超重代谢综合征(MetS)患者餐后代谢组失调涉及多种营养储存和氧化途径。
本研究的目的是进行急性交叉干预，以检查膳食血糖负荷(GL)对超重女性血浆代谢组动态反应的相互作用。
绝经后妇女[63±1.23y;健康(n=20)和MetS (n=20)摄入两种不同的高碳水化合物测试餐(73克碳水化合物;51%的能量)，由低血糖指数(LGI)或高血糖指数(HGI)的食物组成。采用液相色谱-质谱法(LC-MS)分析血浆代谢组。
在患有MetS的超重女性中，餐后对几种氨基酸(aa)的反应受到抑制，包括苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸和色氨酸(p < 0.05)，与膳食类型无关。膳食GL对整体代谢组学反应的影响有限，但餐后丙氨酸水平随低GL膳食而升高，尿酸水平随高GL膳食而升高(p < 0.05)。
在进餐后，met参与者表现出一小组AAs和一组有限的与能量代谢有关的代谢物的浓度差异减小。然而，膳食GL的操纵对餐后代谢组的影响很小。这项研究表明，一餐的GL不是餐后反应的主要决定因素，个体的代谢健康产生更大的影响。
澳大利亚新西兰临床试验注册中心:ACTRN12615001108505 (21/10/2015)
代谢综合征(MetS)是一组对2型糖尿病(T2D)和心血管疾病(CVD)的后续发展具有高度预测性的疾病[1,2]。国际糖尿病联合会(IDF)将met定义为中心性肥胖，再加上两者之一;血压升高、血脂异常[低高密度脂蛋白(HDL)、高低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯]和/或空腹血糖升高[1]。虽然只有少数循环生化中间体有确定的临界值，但数百种代谢物的丰度存在复杂的变化[3,4]。因此，许多代谢途径受到影响，导致MetS预测的疾病病因的异质性[5]。
尽管在营养摄入后代谢通量明显紊乱，但对MetS代谢组学复杂性的分析最常在禁食状态下进行[6,7]。为了进一步了解营养摄入的瞬时代谢组学反应，一种简化的策略是利用口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。OGTT与高通量代谢组学技术相结合，进一步增强了受MetS影响的生化途径的复杂性，包括氨基酸代谢[6,7,8,9,10]。与OGTT不同，膳食是一种高度可变的营养组合[7,9,11,12]。对于高碳水化合物膳食，膳食成分对餐后血糖反应的影响已被广泛研究，作为一种膳食变量，可被操纵以影响长期健康风险[13]。降低单个食物的GI，或者将其应用于计算出的膳食中摄入的碳水化合物的总和，即血糖负荷(GL)，已被用作改善代谢健康的饮食策略[14]。指示多种代谢途径适应的多种代谢物受到膳食调节膳食GL的影响[15];然而，单餐GL的差异是否会对复杂的餐后代谢组产生影响尚不清楚。
因此，本研究的目的是在交叉研究中检查混合试验餐的复杂代谢组学反应，混合试验餐含有高血糖指数(HGI)或低血糖指数(LGI)碳水化合物。为此，招募了一组基于是否存在MetS的女性参与者。利用亲水性相互作用色谱(HILIC)和高分辨率质谱(HRMS)对代谢组进行分析。根据现有文献，假设使用探索性代谢组学方法，氨基酸和相关代谢物的动态变化将被确定，这些代谢物将是对富含碳水化合物的膳食改变的循环代谢组反应的关键随意特征[9,16,17]。
所有受试者均获得书面知情同意。实验方案由奥克兰大学人类参与者和伦理委员会(Ref #014501)审查和批准。该试验在澳大利亚新西兰临床试验注册中心(ANZCTR;ACTRN12615001108505)。
这项研究通过报纸广告和大学社区从奥克兰地区招募了40名绝经后的高加索妇女。符合条件的受试者被要求BMI在18到34 kg/m2之间，年龄在55到70岁之间。有心血管或代谢疾病/病症病史的个体，以及目前正在服用可能干扰研究终点的药物的个体被排除在进一步参与试验之外。按1:1的比例分为两组;根据IDF指南[1]分配的MetS或没有确定的危险因素且体重指数(BMI)在健康范围内(18至25 kg/m2)。
由于非靶向代谢组学的复杂性，目前还没有标准的样本量估计方法[18,19]。因此，实际上，我们采用的样本量是基于先前的研究，考察餐后对测试膳食摄入的反应，以及我们的研究设计和资金来源的经济、伦理和后勤限制[20]。
这项随机交叉试验是在新西兰奥克兰大学利金斯研究所的Maurice和Agnes及Paykel临床研究单位进行的。两种混合膳食(表1)在所有常量营养素中都是相等的;碳水化合物(73 g)、蛋白质(40 g)、脂肪(13 g)和能量(~ 2380 kJ)，主要区别在于所含碳水化合物的血糖生成指数(GI)。每个食物项目直接与悉尼大学GI在线数据库中的食物项目进行匹配[21]。将数据库中没有的食物与具有相似特征的可用食物进行匹配，以实现GI值的估计。日GL的推荐计算公式基于前人的研究[22]，公式如下:
建议参与者保持其饮食习惯、体重和身体活动水平，在试验日前2天停止剧烈运动、膳食补充剂和饮酒。受试者禁食(过夜)到达，在将导管插入趾前静脉之前收集人体测量数据，并在10分钟内摄取基线样本(时间0)，随后在10分钟内食用早餐。将4个餐后样本(30,60,120和300分钟)收集到EDTA采血管中进行代谢组学分析(BD, Mt Wellington，新西兰)。样品在1500×g上4°C离心15 min，上清液收集于微管中，在- 80°C保存待分析。
提取过程在文献[23]的基础上稍作修改。对方案的修改包括由于在较高体积下使用的分析仪器上观察到的过饱和而减少的等离子体体积。此外，1:1 (v/v)氯仿:甲醇混合物偏离了Folch方案，即2:1 (v/v)氯仿:甲醇组合物。简单地说，使用800μl氯仿:甲醇(1:1)的冷冻(- 20°C)混合物，通过液-液萃取提取100μl，然后搅拌并在- 20°C下保持30分钟。然后加入400μl的水，样品旋转30秒，并在12,500×g室温下离心15分钟，以分离水(上)相和有机(下)相。250μl的水相在氮气流下蒸发至干燥，在含有0.1%甲酸和10μg/ml d2-酪氨酸作为内标的300μl乙腈:水(1:1)中重构。空白样品的制备与测试样品完全相同，但血浆用milliq水代替。样品在提取前随机化，以避免系统分析批次和运行顺序的影响。为了验证和保持数据质量，每10个样品注射一次质量控制(QC)样品，包括所有样品的汇集提取物。监测内部标准品的保留时间、信号/强度和质量误差，以检查仪器响应变异性和保留时间偏移。在正电离和负电离模式下，代谢物都得到了正常化，因此，对分析没有运行顺序影响(图S1)。
如前所述，通过LC-MS流分别使用正负电离模式分析血浆提取物和空白物[24]。简单地说，Thermo LC-MS系统(Thermo, Waltham, MA, USA)由Acela 1250四元UHPLC泵，一个配备15,000 psi注射回路的PAL自动进样器组成。Merck聚合物珠基ZIC-pHILIC色谱柱(100 mm × 2.1 mm, 5μm;采用Merck, Darmstadt, Germany)进行色谱分离。色谱柱连接到电喷雾电离的Exactive Orbitrap质谱仪(Thermo, San Jose, CA)。流动相为乙腈-甲酸(99.9:0.1,v/v;溶剂A)和水甲酸铵(16 mM, pH 6.3;样品在25°C下分离，流速为250μl/min，梯度洗脱程序如下:97% a (0-1 min)， 97-70% a (1-12 min)， 70-10% a (12-14.5 min)， 10% a保持(14.5-17 min)，然后返回97% a (17-18.5 min)。最后，在下一次注射前，再保持梯度5.5分钟以达到平衡。样品分别在正负电离模式下运行。正电离参数为:喷雾电压3.5 kV;毛细管温度:325℃;毛细管电压90v，管镜120v。负电离参数如下:喷淋电压，?3.0 kV;毛细管温度:325℃;毛细管电压?90v，管镜?100v。两种模式(任意单元)氮气源脱溶设置相同;护套气40;辅助气体10;扫气5。使用Xcalibur软件包(Thermo, San Jose, CA)，以剖面数据采集模式收集质谱数据，覆盖质量范围为m/z=55-1100，质量分辨率设置为25,000，最大阱填充时间为250 ms。
XCMS软件[25]用于峰检测、对准和噪声消除。生成的峰表使用汇集的QC样本并应用黄土回归模型进行运行顺序校正和批量归一化[26]。在合并的QC样本中，CV > 30%的特征被排除。
代谢组学数据采用线性混合效应模型(LMM)分析。采用R(版本3.1.2)进行统计分析[27]。使用“nlme”包进行LMM[28]。LMM的固定效应/预测因子分配为;“餐”是LGI和HGI餐之间的差异;“状态”表示对照和met之间的差异;“时间”表示五个时间点之间的差异，“参与者”表示随机效应。对于LMM，使用Kenward-Roger校正自由度的条件F检验确定总体效应的p值，该自由度在包装汽车(版本2.0-21)的方差分析函数中实现。使用lme permmodels函数中实现的参数自举来确定分类预测器水平之间差异的P值，具有1000个排列。LMM产生的结果有三个水平:每种代谢物的整体模型的显著性，自变量及其在状态、膳食、时间、逐餐、逐餐、逐餐时间的相互作用的显著性(三方相互作用)，以及(对于事后检验)各组间和组内效应在每个时间点的显著性。通过控制错误发现率(FDR;p < 0.05)[29]，使用R“predictmeans”包(版本1.0.1)[30]。使用R中的tidyverse包进行绘图和附加分析[31]。
通过将峰值识别数据(准确质量和保留时间)与在相同条件下运行的本地标准库进行匹配，对lmm为每次交互生成的重要特征进行注释。如果没有命中，则针对公共领域数据库HMDB和METLIN[32]搜索重要特征。质量误差公差为5ppm。特征标注基于代谢组学标准倡议[33]的置信度(表S1)。
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与健康女性相比，根据MetS分类纳入研究的女性腰围较大(p < 0.001)， BMI较高(p < 0.001)，空腹血糖升高(p=0.003)，甘油三酯升高(p < 0.01)。与健康体重范围内的女性相比，她们的血浆高密度脂蛋白(HDL)也降低了(p=0.027)(表2)。在用餐后，MetS女性表现出更高的餐后胰岛素浓度(餐后15分钟至120分钟;(图1一个;p < 0.05)。餐后血糖反应也存在状态与时间的相互作用(p=0.011)，与健康女性相比，MetS女性在餐后30和45分钟的血糖浓度更高(图1b;p < 0.05)。
A胰岛素和B餐后血糖反应。*健康与MetS之间的差异p < 0.05。LGI与HGI比较，p < 0.05。误差条表示平均值的标准误差
总共提取了203个代谢物特征，其中140个和63个分别在正电离和负电离模式下检测到。在餐后阶段，经LMM分析，23种代谢物表现出显著的相互作用，或为三向相互作用(状态×用餐×时间)，或为双向相互作用(状态×时间或用餐×时间)。这些相互作用主要是AA种。图2包含了那些基于统计上显著的三方交互作用而被区分出来的特征。在30分钟时，只有健康女性的LGI餐的亮氨酸和缬氨酸含量分别高于HGI餐(图2a, b;p < 0.05)。此外，健康女性在60分钟时，HGI餐中的缬氨酸高于LGI餐(图2b;p=0.02)。在健康女性中，30分钟时LGI餐中的苯丙氨酸和色氨酸高于仅HGI餐(图2c, d;p < 0.05)。此外，仅在食用LGI餐时，健康女性在30分钟时的苯丙氨酸丰度比met女性高(p=0.005)。酪氨酸表现出两种三方相互作用;第一个差异是仅在LGI餐中存在差异，与健康女性相比，代谢当量峰值在120分钟时增加。第二个差异是在HGI餐后120分钟，代谢当量在女性中高于健康女性(图2e;p=0.038)。仅在健康女性中，120分钟时HGI餐中的精氨酸高于LGI餐。同样，仅在HGI餐中，健康女性在120分钟时的精氨酸含量高于met女性(图2f;p < 0.05)。
餐后氨基酸表现出三向相互作用。值代表峰值强度的平均值±SEM。ηp < 0.05表示健康女性LGI与HGI的差异，λp < 0.05表示代谢当量女性LGI与HGI的差异，δp < 0.05表示健康女性与代谢当量女性HGI的差异，εp < 0.05表示健康女性与代谢当量女性食用LGI后HGI的差异
图3显示了显示双向交互的AA。与健康女性相比，met女性的苏氨酸和脯氨酸在60分钟和120分钟时减少(图3a, b;p < 0.05)。在30分钟时，与健康女性相比，无论饮食如何，met女性的丙氨酸和尿酸都较高(图3d, e;p < 0.05)。
餐后显著代谢物通过双向相互作用分化。值代表峰值强度的平均值±SEM。*表示MetS与健康女性之间的显著差异。表示HGI和LGI之间的显著差异
除氨基酸外的代谢物也被确定为表现出三方相互作用，如图4所示。与仅在hgi餐后30分钟的健康女性相比，met女性的尿素含量更高(图4a;p=0.015)。在30分钟时，与健康女性相比，仅在HGI餐中，met女性的乳酸含量更高(图4b;p=0.028)。然而，在60分钟时，与仅摄入lgi后的健康女性相比，met女性的乳酸含量更高(图4b;p=0.020)。肌酸表现出两种三向相互作用，第一种仅存在于LGI摄入量中，其中健康女性的丰度高于MetS女性(图4c;p=0.02)。第二种相互作用仅在HGI饮食中出现，其中健康女性的肌酸含量高于met女性(图4c;p=0.005)。仅在健康女性中，LGI与HGI相比，30min后肉碱减少(图4d;p=0.01)。与LMM不同的其余特征如图S2所示。
表现出三方相互作用的非氨基酸。值代表峰值强度的平均值±SEM。ηp < 0.05表示健康女性LGI与HGI的差异，λp < 0.05表示代谢当量女性LGI与HGI的差异，δp < 0.05表示健康女性与代谢当量女性HGI的差异，εp < 0.05表示健康女性与代谢当量女性食用LGI后HGI的差异
目前的研究比较了绝经后有或没有MetS的妇女对两种富含碳水化合物的膳食的血浆代谢组学反应，基于GL的差异。使用非靶向LC-MS策略，结果表明健康和MetS妇女之间循环AAs的差异占主导地位。在高糖饮食和低糖饮食之间，循环AA反应的差异要少得多，也要微妙得多。在明显的反应中，这些反应往往发生在饭后的大连民族学院怎么样第一个小时内，在随后的2小时分析中没有明显的影响。非靶向代谢组学分析还确定了与能量利用途径相关的代谢物，包括乳酸和肉碱，这些代谢物在met女性中表现出更大的餐后偏移。
尽管膳食的设计改变了计算出的GL，但在摄入高GL膳食后，测量的血糖浓度显示met女性只有短暂的小升高反应。对于所有的研究参与者，血糖表现出双相反应，在餐后45 - 60分钟达到最低点。虽然此前有报道称，混合膳食后血糖反应具有双相性[34]，但血糖最低点的快速发作和程度出乎意料。在对一个大型队列进行连续血糖监测时，通常在餐后2-3小时监测血糖最低点，这可能与饥饿的开始相对应[35]。
循环BCAA升高已被证明可预测糖尿病风险[36]。目前的研究和先前的分析表明，MetS患者对混合高碳水化合物餐的血浆BCAA反应没有明显变化[16]。测量到的亮氨酸差异发生在餐后30分钟内，相对于亮氨酸从基线的变化非常小。亮氨酸的这种细微差别不太可能具有生物学意义。血浆缬氨酸丰度在所有餐后都有波动，没有证据表明餐后升高。
无论饮食如何，必需氨基酸酪氨酸在met女性中显示出从60分钟到研究完成(300分钟)丰度增加的趋势。这些结果与胰岛素抵抗个体在不同高蛋白膳食后血浆酪氨酸反应增强的观察结果一致[16]。这推测性地证实了先前的研究表明，清除减少可以增加去甲肾上腺素和多巴胺的生物合成，这两者都与葡萄糖稳态有关[37,38]。健康女性的精氨酸水平在进食HGI后有所增加，而met女性的水平则有所降低。精氨酸对AMPK和mTOR的激活和调节至关重要[39]，也是一氧化氮合成的核心，提示在能量调节和血管稳态中发挥作用[40,41]。需要进一步分析以确定这些观察到的酪氨酸变化对下游代谢物和功能的影响程度。
在目前的研究会展策划与管理专业中，进一步证明了几种氨基酸和能量代谢物在反应中的双向关联。在已确定的AAs中，丙氨酸是值得注意的，因为在患有MetS的女性中，餐后反应往往更大。丙氨酸通过谷氨酸在三羧酸循环(TCA)中提供葡萄糖和脯氨酸的生理平衡[42]。丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)负责丙酮酸转化为丙氨酸，在本试验中，met女性的ALT增加，与先前的观察结果一致，提示肝功能障碍[43]。同时，met女性在餐后两餐时丙氨酸均升高，表明其动力学在很大程度上受代谢风险的影响。相反，血浆苏氨酸和脯氨酸在MetS组中倾向于减少，与膳食无关。
特别令人感兴趣的是，是否可以确定膳食中GL的变化来改变指示氧化代谢改变的代谢物浓度。乳酸是糖酵解的最终产物，其血浆浓度指示Cori循环的通量，乳酸从糖酵解活性组织输出到血浆，在肝脏中合成葡萄糖[44]。据报道，胰岛素抵抗个体在OGTT后的头2小时内乳酸浓度升高，推测这是氧化能力受损的一个指标[45,46]。在本研究中，代谢当量和膳食GL对血浆乳酸浓度的影响微妙而短暂，持续到60分钟。这些变化的小而短暂的性质表明，在本研究中使用的膳食背景下，乳酸的动态响应不能很好地指示代谢当量，也不能区分高GI或低GI的膳食。
禁食肌酸与MetS有关[47]，在能量缓冲中起着重要作用。健康女性的肌酸立即增加了15%，而代谢障碍女性的肌酸则下降了10%。与乳酸一样，这些差异仅在第一次餐后样品(30分钟)中明显，随后不会持续存在。这些差异可能表明能源利用方面存在严重差异，但需要更仔细的分析。
本研究有重要的考虑和局限性。这些调查仅限于绝经后的老年高加索女性，因此，在将这些结果推广到男性、年轻人或多种族时需要谨慎。此外，虽然代谢组学已经为健康女性和MetS女性餐后特征之间的差异提供了重要的见解，但它并没有详2021年电大改革细了解由于不同表型的膳食分解而导致的吸收率或组织清除率的差异。此外，膳食的选择可能会影响到这些结果可以推广的程度。未来的研究可以通过在食物中加入稳定同位素来解决这个问题，从而能够精确分析代谢物的通量。鉴于没有对样本量计算的正式估计和LC-MS分析的非针对性，本研究应被视为潜在的试点，为未来的研究提供指导。
总之，对餐后妇女血浆样本进行的非靶向代谢组学分析表明，与年龄匹配且代谢更健康的女性相比，超重妇女(其特征是具有MetS)的一系列AAs和几种能量相关代谢物存在微小且短暂的差异。此外，本研究中使用的膳食选择对测量的代谢组学反应没有显着影响。因此，这项研究无法令人信服地证明膳食GL的差异是否在改变餐后代谢方面具有重要意义，从而有利于体重调节和代谢健康。然而，这些数据强调了由天然食物组成的餐后反应的复杂性，继续需要对系统对不同膳食类型的生物反应进行更详细的了解。
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